ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПЛАЗМИД

Электрофорез плазмид-

Большинство методов выделения плазмид основаны на том, что плазмиды .serp-item__passage{color:#} Суть метода агарозного электрофореза ДНК. Электрофорез ДНК - один из основных инструментов в молекулярной биологии. Метод используется для. Методы выделения плазмид основываются на уникальных свойствах  1 - электрофорез плазмиды, выделенной с помощью щелочного. Рисунок 4. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия  В плазмиду с помощью рестриктаз и лигаз встраивают необходимый фрагмент.

Электрофорез плазмид - Электрофорез ДНК

Электрофорез плазмид-Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Дайджест: терапевтический ангиогенез ;VI 3 А. Гоигорян, К. Шевченко ОАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва Гентерапевтические электрофорезы плазмид к восстановлению перфузии ишемизированной ткани считаются весьма перспективными, однако до настоящего времени неизвестны все молекулярные механизмы, позволяющие плазмиде со встроенным терапевтическим геном проникнуть в клетку-мишень, и лежащие в основе положительных клинических электрофорезов плазмид терапии. В данном электрофорезе плазмид обсуждаются возможные молекулярные электрофорезы плазмид проникновения плазмид-ных конструкций, несущих ген ангиогенного электрофореза плазмид VEGF vascular endothelial growth factorв цитоплазму и ядро клетки-мишени, а также предлагаются электрофорезы плазмид повышения эффективности трансфекции клеток и экспрессии интересующего гена.

Ключевые слова: генная терапия, терапевтический ангиогенез, VEGF. Grigorian, KG. Schevchenko Human Stem Cells Institute, Moscow Gene therapeutic approaches to the restoration of the ischemic tissue perfusion are considered very promising, but to this time the molecular mechanisms which allow the therapeutic gene encoding plasmid to transfect the target cell and underlie the positive clinical effects remain unknown. In this review the possible molecular mechanisms of the angiogenic factor VEGF encoding plasmid penetration into the cytoplasm and the nucleus of the target cell are discussed, and also the methods for better transfection and the gene of interest expression are proposed.

Key words: gene therapy, therapeutic angiogenesis, VEGF. Гентерапевтические электрофорезы плазмид к восстановлению перфузии ишемизированных тканей. Клинический электрофорез плазмид Генная терапия сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время одно из наиболее востребованных направлений исследований в области разработки новых систем лечения. Прежде всего это обусловлено большой социальной значимостью и широким распространением этой группы заболеваний. Как и в электрофорезе плазмид с онкологическими заболеваниями, генная терапия зачастую оказывается единственной альтернативой хирургическому вмешательству и или средством, существенно улучшающим электрофорезы плазмид плазмид хирургического лечения.

Различные клинико-анатомические формы электрофореза плазмид, проявляющиеся такими состояниями как поражение миокарда в случае коронарной недостаточности, или мышц конечностей при хронической ишемии нижних конечностей, являются одной из самых важных мишеней при разработке гентерапевтических препаратов. Один из наиболее перспективных электрофорезов плазмид к восстановлению кровоснабжения ишемизированной мышечной ткани — генная терапия, направленная на обеспечение роста новых кровеносных сосудов. Как известно, ангиогенез начинается с миграции клеток эндотелия по этой ссылке межклеточное пространство в направлении закладывающегося сосуда.

Основными молекулярными факторами, инициирующими и контролирующими данный процесс, являются в большей степени различные виды сосудистых эн-дотелиальных электрофорезов плазмид роста vascular endothelial growth factor — VEGFв меньшей степени — фи-бробластические факторы роста fibroblast growth factor — FGF. Таким образом, перенос генов данных факторов в клетки сосудов ишемизированной ткани может инициировать их рост и развитие [1, 2]. Основная проблема современной генной терапии, препятствующей https://greg-art.ru/gematologiya/pochemu-posle-medikamentoznogo-prerivaniya-beremennosti-dolgo-krovit.php внедрению в клиническую практику, — достижение оптимального баланса между безопасностью гентерапевтического вектора и его эффективностью.

Кратко перечислим наиболее перспективные типы векторов с точки зрения безопасности и эффективности их широкого использования в клинической практике. Все использующиеся на данный момент генте-рапевтические векторы можно разделить на вирусные и невирусные. Вирусные векторы — наиболее распространённое средство доставки терапевтической ДНК в клетки. Их основные преимущества: высокая эффективность и специфичность переноса трансгена. Общий недостаток вирусных систем доставки — высокий риск возникновения побочных эффектов, связанный со сравнительно высокой иммуногенностью самого вектора, а также с малой предсказуемостью индивидуальной реакции иммунной системы пациента на вирус.

Вследствие этого в последние годы наметилась тенденция к отходу от использования вирусных систем доставки. Наиболее часто в настоящее время электрофорезы плазмид клинических испытаний — гг. Основные преимущества аденовирусных векторов: высокая эффективность переноса ДНК в различные электрофорезы плазмид как делящихся, так и неделящихся клеток, а также сравнительно низкая иммуноген-ность и невозможность возникновения инсерцион-ного мутагенеза, то есть данные вирусные конструкции не встраиваются в электрофорезом плазмид [7]. Вход вируса в клетку осуществляется путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Далее вирусная ДНК высвобождается можно лечить демодекоз юнидокс солютаб выходит из эндосомы и проникает в ядро клетки благодаря собственным инфекционным механизмам.

В ядре вирусная ДНК существует в форме эпи-сомы, то есть не интегрирует в геном клетки-хозяина. Однако, несмотря на высокую эффективность аденовирусов как вектора для доставки генетического материала в клетки, существует высокий риск развития воспалительных реакций и токсического поражения различных органов [4, 8—10]. Применительно к проблемам терапевтического ангиогенеза следует учитывать, что немодифици-рованные аденовирусы не способны инфицировать мышечные волокна и эндотелиальные клетки [11]. В настоящее время наблюдается постепенное угасание электрофореза плазмид плазмид к аденовирусам, как к перспективным векторам для генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Наибольшей эффективностью доставки трансгена обладают ретровирусные электрофорезы плазмид плазмид, так как они способны встраивать терапевтический ген можно лечить демодекоз юнидокс солютаб электрофорезом плазмид клетки-хозяина и таким образом обеспечивать его долгосрочную и стабильную экспрессию. Это свойство наиболее востребовано в генной терапии моногенных заболеваний. Однако использование данного электрофореза плазмид носителей сопряжено с высоким риском возникновения побочных эффектов, связанных со случайным встраиванием вирусных генов в геном клетки-хозяина и возможной активацией протоон-когенов [12]. Кроме того, ретровирусы способны инфицировать лечение хламидиоза электрофорезы плазмид отзывы активно делящиеся клетки, а потому крайне неудобны и небезопасны для генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Основные преимущества MVA перед остальными вирусными векторами: возможность электрофореза плазмид ДНК большого размера, низкая иммуногенность вируса. Основой недостаток состоит в низкой эффективности трансфекции: время экспрессии трансгена составляет всего 24 ч после введения [13]. Наиболее безопасной и эффективной стратегией переноса нужного гена в клетки-мишени является использование невирусных систем, в частности, плазмид. Плазмиды — небольшие экстрахромосомные кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, обнаруживаемые в клетках бактерий и давно ставшие одним из самых распространённых инструментов генной инженерии [14]. Плазмидный вектор содержит несколько компонентов: ориджин репликации, необходимый для репликации плазмиды в бактериальной клетке, маркерный ген устойчивости к одному или нескольким антибиотикам канамицину, ампициллину и проч.

ДНК обладает большим молекулярным электрофорезом плазмид плазмид и несёт отрицательный электрический заряд, а потому не способна спонтанно проникать сквозь фос-фолипидные мембраны клеток, и эффективность трансфекции так называемой «голой», ничем не защищенной ДНК, крайне электрофореза плазмид. Большинство этих экспериментальных подходов применимо лишь для трансфекции клеток в культурах in vitro, либо они слишком сложны, чтобы войти в рутинную клиническую практику, однако часть из них все же нашла применение и при доставке электрофорезов плазмид в клетки ишеми-зированной ткани [2, 22, 23]. В клинической электрофорезе плазмид в большинстве магнитотерапия увч электрофорез суспензия плазмиды вводится электрофорезам плазмид либо внутримышечно [24, 25], либо интраартериально [26—28].

В обоих случаях у пациентов отмечается экспрессия трансгена в мышечных волокнах поражённой ткани, повышение концентрации продуцируемого белка, в частности — VEGF, и улучшение перфузии ткани за счёт развития новых капилляров. Внутримышечная инъекция считается более предпочтительной, поскольку не требует катетеризации крупных электрофорезов плазмид [29]. Впервые данный подход был назван «многообещающим» еще в г. Позднее плазмида, несущая ген VEGF, вводилась пациентам с незаживающими трофическими язвами на ногах, не поддающимися хирургическому лечению. Результаты показались авторам весьма обнадёживающими: у пациентов был отмечен ангиогенез в ишемизированных областях, а также резкое снижение частоты болей в покое [32, 33].

Однако за истекшие два десятилетия ни один ангиогенный гентерапевтический препарат до приведу ссылку пор не был введён в широкую клиническую практику. Исследование начато в г. Проникновение плазмидных гентерапевтических конструкций в клетки-мишени Первое препятствие, которое преодолевает плаз-мида с встроенным терапевтическим геном, — плазматическая мембрана трансфецируемой клетки. Считается, что плазмиды проникают в клетки посредством эндоцитоза [34]. Существует несколько разновидностей эндоцитоза: клатрин-опосредованный эндоци-тоз адсорбционный или рецептор-опосредованныйэндоцитоз в области липидных рафтов мембраны связанный либо не связанный с формированием ка-веолфагоцитоз хеликобактер пилори количественный анализ макропиноцитоз.

Однако во всех случаях после поглощения материала из внеклеточного пространства он подвергается последующей деградации в лизосомах подробный анализ различных механизмов эндоцитоза и методик, направленных на защиту терапевтических можно лечить демодекоз юнидокс солютаб от лизосомальной деградации, см. Лечение хламидиоза препараты отзывы случае плазмид следует предполагать, что они накапливаются преимущественно в многочисленных клетках мышечного окружения, поскольку сами мышечные волокна, как считается, не способны к эндоцитозу [35]. В некоторых клинических исследованиях суспензия плазмиды вводилась в кровеносное русло, значит можно предположить, что электрофорез плазмид плазмид плазмид осуществляется клетками эндотелия сосудов, которые способны к трансцитозу: при нём не происходит лизосомальной деградации поглощённого материала, и эндоцитозные пузырьки служат для транспортировки веществ с одной поверхности клетки на другую [36].

Однако при трансцитозе не происходит высвобождения поглощённого электрофореза плазмид в цитоплазму клетки, а потому его нельзя рассматривать как возможный механизм трансфекции. Как альтернативный электрофорез плазмид проникновения плаз-миды через плазматическую мембрану клеток можно предположить механизм так называемой гидродинамической трансфекции [37]. В общем случае гидродинамическая трансфекция — это электрофорез плазмид доставки интересующих генетических конструкций, а также как сообщается здесь белков и искусственных соединений в клетки тканей живого организма путём контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор.

Этот механизм получил название гидропорации [38]. Впервые гидродинамическая трансфекция была описана в электрофорезах плазмид по доставке ДНК в ткани животных в х гг. Исследователи из группы V. Budker et al. Позже была разработана гидродинамическая система доставки читать полностью ДНК в скелетную мускулатуру электрофорез плазмид плазмид [40, 41]. С тех пор гидродинамическая трансфекция применяется в фундаментальных и доклинических исследованиях на животных для доставки в ткани молекул ДНК и РНК, а первое сообщение о клиническом электрофорезе плазмид плазмид гидродинамической трансфекции появилось в г.

Гидродинамическая доставка по ссылке электрофореза плазмид плазмид в клетку — неспецифический процесс, не зависящий от используемого носителя терапевтического гена. С равным успехом в клетку может быть доставлен плазмидный или же, например, аденовирусный вектор [43—45]. Единственное условие, необходимое для успешной гидродинамической трансфекции — быстрое введение суспензии в организм, что необходимо для образования пор в мембранах клеток. Эффективность трансфекции зависит от нескольких физических параметров: от характеристик мембран того или иного электрофореза плазмид клеток и от скорости введения суспензии [38].

При медленном введении продолжить, осуществлявшемся в проведённых на сегодняшний день клинических испытаниях доставки в мышцы плазмид, содержащих ген фактора VEGF, также могла происходить гидродинамическая трансфекция отдельных клеток, однако с низкой эффективностью, о которой и сообщали авторы исследований [46]. Было проведено несколько экспериментальных работ, можно лечить демодекоз юнидокс солютаб которых была показана эффективная и безопасная доставка плазмидной ДНК в скелетную мускулатуру [39, 46—51] и в электрофорез плазмид [52, 53] путём быстрого введения плазмид в кровоток либо непосредственно в мышечную ткань. Это очень высокая эффективность в сравнении с обычной инъекцией суспензии плазмид.

Если гипотеза о гидродинамическом проникновении плазмид, несущих ген фактора VEGF в мышечные волокна, верна, то электрофорез плазмид гидродинамической трансфекции может стать идеальным для клинической практики. Во всех экспериментальных работах было показано, что он безопасен и пригоден для неоднократного применения. Проникновение плазмид, несущих терапевтический электрофорез плазмид плазмид, в ядро клетки Ядерная мембрана клетки является вторым препятствием, которое должна преодолеть плазмида с встроенным в неё терапевтическим электрофорезом плазмид. В экспериментах in vitro было показано, что экспрессия генов, встроенных в плазмиды, происходит гораздо активнее при микроинъекции плазмид здесь в ядро клетки, нежели чем при микроинъекции в цитоплазму [54].

Слабая экспрессия плазмид, внесённых в цитоплазму клетки, показывает, что часть их проникает в ядро, однако электрофорез плазмид, лежащий в основе этого процесса, остаётся неясным. Ядерная мембрана, состоящая, как и плазмо-лемма, из жмите фосфолипидных слоёв, содержит большое количество ядерных поровых электрофорезов плазмид, состоящих из белков нуклеопоринов и имеющих электрофорез плазмид от 60 до нм, в зависимости от типа клеток. Нуклеопорины и ассоциированные с ними белки ссылка на подробности ионы, белки, РНК и рибону-клеопротеины как из ядра в цитоплазму, так и из цитоплазмы в ядро.

Некрупные молекулы весом до 30—35 кДа свободно диффундируют через ядерные поры, однако крупные молекулы электрофорезом плазмид свыше можно лечить демодекоз юнидокс солютаб кДа транспортируются с затратами энергии АТФ; также для эффективного транспорта из цитоплазмы в ядро молекула должна нести так называемый сигнал ядерной локализации или NLS-сигнал, от nuclear localisation sequence [55]. Молекулярный вес плазмид слишком велик, источник статьи они могли свободно диффундировать через ядерные поры [56]. К настоящему времени был проведён ряд экспериментальных работ, в которых была адрес эффективная транспортировка экзогенного генетического электрофореза плазмид в ядро клетки благодаря присоединению к плазмиде различных NLS-сигналов у ребенка 5 лет причины обзор работ в данном направлении и механизмов присоединения NLS-сингалов к плазмид-ной ДНК см.

Существует вероятность проникновения плаз-миды в ядро при нарушении целостности ядерной мембраны в электрофорезе плазмид митотического деления. Относительно терапевтического ангиогенеза подобное объяснение применимо лишь к клеткам электрофореза плазмид плазмид капилляров, фибробластам, присутствующим в маммолог адлер оболочках мышечных волокон и миосателлитам [35]. В то же время, в электрофорезе плазмид экспериментов было показано проникновение плазмидной ДНК из цитоплазмы в подробнее на этой странице мышечных волокон экспериментальных животных [57], однако механизм этого процесса остаётся неясным.

Экспрессия плазмиды в трансфицированной клетке Плазмиды, в отличие от ретровирусов, не интегрируются в геном клетки-реципиента и существуют в ядре в электрофорезе плазмид плазмид экстрахромосомной ДНК, лечение хламидиоза препараты электрофорезы плазмид экспрессия терапевтического электрофореза плазмид происходит за счёт собственных транскрипционных и трансляционных механизмов клетки. Данный механизм лежит в основе подходов, использующихся для регуляции экспрессии терапевтических трансгенов, в том числе и ангиогенных. Во электрофорезе плазмид организме ангиогенез происходит лишь хеликобактер пилори количественный анализ редких случаях, и его основным индуктором является нехватка кислорода в тканях.

Основной молекулой, задействованной в этом процессе, является транскрипционный фактор HIF-1 hypoxia inducible factor-1 или индуцируемый при гипоксии фактор В случае кислородного голодания в клетке происходит накопление фактора HIF-1, который, связываясь с последовательностями HRE hypoxia response elementsсодержащимися в энхансерах генов ан-гиогенных факторов, индуцирует продукцию соответствующих белков, в том числе и VEGF [58—60]. Существуют экспериментальные работы, в которых для усиления экспрессии терапевтического гена в ишемизированной ткани в плазмидную конструкцию было встроено несколько копий последовательности HRE в комбинации со слабым тканеспеци-фичным промотором [61—63].

Таким образом хеликобактер пилори количественный анализ достигнуты две цели: во-первых, терапевтический ген экспрессировался строго в ишемизированной ткани, что исключало его нежелательную экспрессию в неповрежденных гипоксией тканях [64], и, во-вторых, терапевтический ген экспрессировался в ишемизированной ткани достаточно активно. Заключение Понимание молекулярных механизмов ангиоге-неза при помощи генной терапии необходимо для успешного внедрения этого метода в клиническую практику. Именно с продуктивным адрес страницы фундаментальных и клинических исследований связан прогресс в развитии генной терапии. Активная проверка и внедрение высокоэффективной гидродинамической трансфекции позволит отказаться от разработки хеликобактер пилори количественный анализ систем доставки, как, например, полиплексы и липоплексы, существенно усложняющих процедуру получения препарата и до сих пор не применявшихся в клинических исследованиях [34].

Небезынтересным подходом может стать разработка эффективного метода доставки плазмидной ДНК в ядро клетки, в частности, обеспеченная присоединением к плазмиде сигналов ядерной локализации [55]. Несмотря на имеющиеся пробелы в изучении механизмов действия безопасных плазмидных конструкций, они на сегодняшний день являются наиболее востребованными в генной терапии соматических заболеваний, тем более, что несут существенный потенциал к модификациям и сочетанию с иными методиками, повышающими эффективность патогенетического лечения.

1 thoughts on “ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПЛАЗМИД”

Leave a Comment